Введение

Описание задачи

Аспергилл (Aspergillus) – род плесневых грибов, который является одним из самых используемых и в тоже время самых вредных для здоровья. Некоторые виды аспергиллов (в частности A. niger и A. oryzae) используются в промышленности для выполнения процессов ферментации различных продуктов, а другие виды, главным образом A. flavus и A. parasiticus, производят токсичные и вторичные канцерогенные метаболиты - афлатоксины.

Афлатоксины – микотоксины, производимые грибами из рода аспергилла. Афлатоксины являются контаминантами, встречающимися в разнообразных продуктах, таких как: зерно, кукуруза и арахис. Эти соединения достаточно стабильны и выдерживают относительно высокие температуры (способны выдержать процессы пастеризации и ферментации молока), они вызывают поражение печени, влияют на репродуктивную систему, подавляют иммунитет. Главные виды афлатоксина: B1, B2, G1 и G2 ядовиты. Афлатоксин М1 является метаболитом афлатоксина B1, М1 производится в печени крупного рогатого скота из B1. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) включила Афлатоксин М1 в группу канцерогенов 2B (вероятно канцерогенно для человека), данный канцероген встречается в молоке млекопитающих, которые употребляют в пищу продукты зараженные афлатоксином В1.

ВОЗ оценивает афлатоксины, как соединения, несущие серьезный риск для здоровья, и указывает, что данные контаминанты часто присутствуют в пище. Ниже представлено описание метода определения Афлатоксина М1 в молоке. Данный метод включает в себя очистку образца через иммуноафинную колонку и хроматографический анализ с использованием спектрофлуориметрического детектора. Подготовка образцов требует точного выполнения всех этапов.

Описание метода твёрдофазной экстракции

Образцы и реагенты

Реагенты и химикаты уровня ACS (особо чистые). Афлатоксин М1 получен от Sigma-Aldrich (PN A6428). Ацетонитрил предоставлен Panreac AppliChem (PN 3611881). Вода очищена с помощью установки Milli-Q (допустимо использовать аналогичное оборудование), картриджи VICAM Afla M1 HPLC

Подготовка образцов перед твёрдофазной экстракции

1. Нагрев образцов молока до 37± 2 0С.
2. Центрифугирование в течение 15 минут при 4000 об/мин (2800 х g).
3. Удаление верхнего жирового слоя
4. Фильтрация образцов через бумажный фильтр
5. Дозирование образцов объемом 50 мл по пробиркам Falcon, которые размещаются в штативах для системы GX-271 ASPEC.

Метод твёрдофазной экстракции

Метод твёрдофазной экстракции был выполнен с помощью системы GX-271 ASPEC. Иммуноффинная очистка Афлатоксина М1 и дальнейшая подготовка образцов к ВЭЖХ анализу были выполнены следующим образом:

1. Загрузка 50 мл подготовленного образца со скоростью потока 1.5 мл/мин.
2. Промывка водой объемом 20 мл со скоростью потока 3 мл/мин, загрузка в картридж сжатого воздуха - 24 мл при 40 мл/мин для вытеснения воды (с помощью функции Air Push в программе Trilution LH).
3. Элюирование в 2 этапа, на обоих этапах используются 2 мл ацетонитрила, скорость потока 1 мл/мин, после второго этапа элюирования в картридж загружается сжатый воздух объемом 20 мл при 40 мл/мин для вытеснения аналита.
4. Выпаривание 4 мл собранного экстракта в водяной бане при 50 0С в азотной среде.
5. Растворение сухого экстракта в подвижной фазе объемом 50 мкл (вода/ацетонитрил 67/33), фильтрация с помощью модифицированной PTFE мембраны, и заморозка образцов до выполнения ВЭЖХ анализа.

Система GX-271 ASPEC в комплекте со штативами серии DEC позволяет выполнять автоматически все стадии твердофазной экстракции (кондиционирование, загрузка, промывка и элюирование). Ниже представлена графическая схема метода ТФЭ, разработанный в программе Trilution LH V 4.0.

ВЭЖХ анализ

ВЭЖХ анализ был выполнен на спектрофлуориметрическом детекторе. Спектр поглощения/спектр флуоресценции: 365/435 нм.

Результаты и выводы

Очистка образца и экстракция Афлатоксина М1 из молока была полностью выполнена с помощью системы GX-271 ASPEC, иммуноафинные картриджи Afla M1 HPLC VICAM были размещены в штативах серии DEC (специальная серия штативов Gilson для твёрдофазной экстракции).

Повторяемость, воспроизводимость и степень извлечения

Повторяемость, воспроизводимость и степень извлечения были оценены исходя из результатов, полученных двумя различными специалистами в разные дни. Анализ проб методом ВЭЖХ проводился при трех различных концентрациях. Ниже представлена ВЭЖХ диаграмма.

Суммарные результаты повторяемости, воспроизводимости и степени извлечения представлены в таблице ниже

* Степень извлечения представленного эксперимента получилась более 100%, что может указывать на неправильный расчет изначальной концентрации афлатоксина в молоке, неправильную калибровку детектора, ошибку расчета площадей, либо на влияние матричных компонентов в пробах

Суммарные результаты повторяемости, воспроизводимости и степени извлечения представлены в таблице ниже

Афлатоксин М1
Предел обнаружения (мкг/л)	0.02
Предел определения(мкг/л) *	0.12

* Предел определения был принят за минимальную концентрацию.

Заключение

Методы на базе ELISA (иммуноферментного анализа) позволяют легко определять наличие микотоксинов, но данная технология может давать ложноположительные результаты, поэтому проведение ВЭЖХ анализа более предпочтительно для точного количественного определения токсинов. ВЭЖХ анализ требует тщательной подготовки образцов и участия высококвалифицированного персонала для своего выполнения. Ниже приведены преимущества подготовки образцов с помощью системы GX-271 ASPEC:

• Загрузка образцов большого объема (50 мл) с высокой точностью и воспроизводимостью.
• Совместимость системы GX-271 ASPEC со стандартным лабораторным оборудованием (пробирки Falcon)
• Возможность выполнять элюирование в несколько шагов для улучшения степени извлечения
• Не требующая контроля, полностью автоматизированная подготовка образцов освобождает персонал для выполнения более трудоемких задач.

Система GX-271 ASPEC совместима не только с картриджами Silica, C18, CSX, WCX, HLB Gilson, но и всеми ТФЭ картриджами на 1, 3 и 6 мл других производителей.