Лабораторное и аналитическое оборудование
Мы сертифицированы ИСО 9001
Тел.  +7 (495) 964 47 48
Факс +7 (495) 964 47 39
GILSON

Автоматизированная экстракция патулина из яблочного сока
с помощью системы Gilson GX-271 ASPEC

Введение

система твердофазной экстракции Gilson GX-271 ASPEC

Требования к качеству продуктов питания постоянно растут, на пищевых производствах необходим строгий контроль технологических процессов для обеспечения безопасности продукции. С данной задачей помогает успешно справиться внедрение автоматизированных решений для методов твердофазной экстракции, что позволяет повышать чувствительность и специфичность методов на этапе предварительной очистки образцов.

Автоматизация методов твердофазной экстракции с использованием картриджей, наполненных молекулярно импринтированными полимерами (MIP), позволяет эффективно выполнять очистку образцов. Приведенный ниже метод описывает извлечение патулина (а так же его примесей) из яблочного сока. Данный метод, выполненный на системе Gilson GX-271 ASPEC, легко воспроизводим, применим для различных продуктов из яблок, не требует контроля за его выполнением

Описание задачи

Патулин – микотоксин, производимый различными плесневыми грибами, особенно из родов Аспергилл и Пенициллин. Данный токсин часто встречается в гниющих яблоках. Содержание патулина обычно используется как показатель качества яблок, используемых в производстве продуктов питания. Исследования указывают на генотоксичность патулина, как результат, во многих странах есть ограничения на присутствие данного соединения в продуктах. Данное соединение восприимчиво к УФ излучению, которое может оказывать влияние на результаты анализа. В то же время многие методы очистки не удаляют похожие по структуре соединения, что может приводить к ложноположительным результатам в исследованиях (например, не всегда удается извлечь 5-гидроксиметилфурфол, который мешает правильно выполнить количественное определение патулина).

В различных странах Европейского Союза установлены нормы максимально допустимой концентрации патулина от 25 мкг/кг до 50 мкг/кг в зависимости от продукта. Нижняя граница наличия патулина в продуктах - 10 мкг/кг (данная норма установлена для продуктов детского питания). [European Commission (EC) regulation 1881/2006]

Для выполнения поставленных задач был разработан новый метод экстракции патулина из яблочных продуктов с использованием системы Gilson GX-271 ASPEC и картриджей AFFINIMIP Patulin, которые наполнены молекулярно импринтированным полимером (MIP) специфичным к патулину.

Образцы и реагенты

Все реагенты и химикаты уровня ACS (особо чистые). Патулин был заказан у фирмы Sigma Aldrich (Fluka). Яблочный сок был куплен в супермаркете. Некоторые образцы яблочного сока были загрязнены патулином концентрацией 25 мкг/кг, другие 40 мкг/кг, что позволило более точно определить степень извлечения. Картриджи - Affinisep AFFINIMIP Patulin в упаковке по 3 мл, загерметизированные специальными полипропиленовыми крышками Gilson.

Протокол твердофазной экстракции

На предварительном этапе 2.5 мл яблочного сока растворяются в 2.5 мл 2% водного раствора уксусной кислоты, полученный раствор перемешивается. Метод твердофазной экстракции выполняется на системе Gilson GX-271 ASPEC под управлением программы Trilution LH, он содержит следующие этапы:

  1. Кондиционирование картриджа – 2 мл ацетонитрила, затем 1 мл деионизированной воды, скорость потока 1 мл/мин.
  2. Загрузка раствора в картридж - 4 мл подготовленного раствора яблочного сока, скорость потока 0.5 мл/мин.
  3. Промывка картриджа – 1 мл 1% водного раствора NaHCO3, скорость потока 1 мл/мин.
  4. Промывка картриджа - 2 мл деионизированной воды, скорость потока 1 мл/мин, после промывки в картридж загружается 1000 мкл сжатого воздуха для вытеснения воды (используется функция Air push из программы Trilution LH).
  5. Промывка картриджа - 500 мкл диэтилового эфира, скорость потока 1 мл/мин.
  6. Элюирование патулина - 2 мл этилацетата, скорость потока 0.8 мл/мин.

Данный метод твердофазной экстракции занимает примерно 35 минут. Затем элюированная фракция выпаривается и растворяется в 0.1% водном растворе уксусной кислоты. Время выпаривания – примерно 10 минут.

Иллюстрация этапов полностью автоматизированного метода, разработанного в программе Trilution LH:

Иллюстрация этапов полностью автоматизированного метода, разработанного в программе Trilution LH

Результаты и выводы

Приведенное описание метода показывает, как можно выполнять очистку образцов от патулина с помощью твердофазной экстракции, используя картриджи с MIP специфичные к патулину.

Молекулярно импринтированные полимеры (MIP) – синтетические материалы с искусственно созданной трехмерной сетью, способные специфично связываться с целевой молекулой.

Молекулярно импринтированные полимеры имеют ряд преимуществ: высокая селективность и специфичность, термоустойчивость, совместимость со всеми растворами и низкая себестоимость. Данные полимеры используются, как эффективное средство для очистки и предварительного концентрирования патулина.

Процесс очистки образцов яблочного сока от патулина:

Процесс очистки образцов яблочного сока от патулина

ВЭЖХ анализ был выполнен на системе с DAD детектором, патулин определялся на длине волны 276 нм, инжекционный объем – 100 мкл.

ВЭЖХ анализ был использован для количественного определения патулина в образцах. Ниже приведено сравнение хроматограмм образцов яблочного сока загрязненного патулином концентрацией 25 мкг/кг до очистки и после.

ВЭЖХ анализ был использован для количественного определения патулина в образцах

ВЭЖХ диаграмма, приведенная ниже, имеет две хроматограммы после очистки образцов, которые были загрязнены патулином концентрацией 40 мкг/кг. График был масштабирован, а ось X хроматограмм смещена для отображения результатов воспроизводимости, полученных данным методом.

ВЭЖХ диаграмма

Данный метод очистки образцов соответствует нормам ЕС 401/2006. Указанные нормы требуют, чтобы степень извлечения превышала 70% для анализов с концентрацией патулина от 20 до 50 мкг/кг, а так же 50% для анализов с концентрацией ниже 20 мкг/кг. Как показано в таблице 1, данный метод очистки яблочного сока от патулина, загрязненного при концентрации 40 мкг/кг, имеет степень извлечения 80%, что соответствует требованиям ЕС.

Концентрация (нг/мл) Степень Извлечения % Повторяемость RSDR (%)
40 (n=2) 80 Не определена

Приведенный метод легко автоматизируется на системе Gilson GX-271 ASPEC, которая обеспечивает высокую повторяемость и воспроизводимость результатов, а так же не требует контроля за ее работой. Gilson GX-271 ASPEC в комплекте с картриджами специфичными к патулину была принята в использование более чем 50 заказчиками, особенно в индустриальных лабораториях контроля качества (Industrial QC labs) в 20 различных странах. Картриджи, наполненные молекулярно импринтированным полимером (MIP) специфичным к патулину, зарекомендовали себя эффективным средством очистки различных продуктов из яблок.

Дополнительная информация по методам твердофазной экстракции и применению автоматов GX Gilson