Введение

Описание задачи

Патулин – микотоксин, производимый различными плесневыми грибами, особенно из родов Аспергилл и Пенициллин. Данный токсин часто встречается в гниющих яблоках. Содержание патулина обычно используется как показатель качества яблок, используемых в производстве продуктов питания. Исследования указывают на генотоксичность патулина, как результат, во многих странах есть ограничения на присутствие данного соединения в продуктах. Данное соединение восприимчиво к УФ излучению, которое может оказывать влияние на результаты анализа. В то же время многие методы очистки не удаляют похожие по структуре соединения, что может приводить к ложноположительным результатам в исследованиях (например, не всегда удается извлечь 5-гидроксиметилфурфол, который мешает правильно выполнить количественное определение патулина).

В различных странах Европейского Союза установлены нормы максимально допустимой концентрации патулина от 25 мкг/кг до 50 мкг/кг в зависимости от продукта. Нижняя граница наличия патулина в продуктах - 10 мкг/кг (данная норма установлена для продуктов детского питания). [European Commission (EC) regulation 1881/2006]

Для выполнения поставленных задач был разработан новый метод экстракции патулина из яблочных продуктов с использованием системы Gilson GX-271 ASPEC и картриджей AFFINIMIP Patulin, которые наполнены молекулярно импринтированным полимером (MIP) специфичным к патулину.

Образцы и реагенты

Все реагенты и химикаты уровня ACS (особо чистые). Патулин был заказан у фирмы Sigma Aldrich (Fluka). Яблочный сок был куплен в супермаркете. Некоторые образцы яблочного сока были загрязнены патулином концентрацией 25 мкг/кг, другие 40 мкг/кг, что позволило более точно определить степень извлечения. Картриджи - Affinisep AFFINIMIP Patulin в упаковке по 3 мл, загерметизированные специальными полипропиленовыми крышками Gilson.

Протокол твердофазной экстракции

На предварительном этапе 2.5 мл яблочного сока растворяются в 2.5 мл 2% водного раствора уксусной кислоты, полученный раствор перемешивается. Метод твердофазной экстракции выполняется на системе Gilson GX-271 ASPEC под управлением программы Trilution LH, он содержит следующие этапы:

1. Кондиционирование картриджа – 2 мл ацетонитрила, затем 1 мл деионизированной воды, скорость потока 1 мл/мин.
2. Загрузка раствора в картридж - 4 мл подготовленного раствора яблочного сока, скорость потока 0.5 мл/мин.
3. Промывка картриджа – 1 мл 1% водного раствора NaHCO3, скорость потока 1 мл/мин.
4. Промывка картриджа - 2 мл деионизированной воды, скорость потока 1 мл/мин, после промывки в картридж загружается 1000 мкл сжатого воздуха для вытеснения воды (используется функция Air push из программы Trilution LH).
5. Промывка картриджа - 500 мкл диэтилового эфира, скорость потока 1 мл/мин.
6. Элюирование патулина - 2 мл этилацетата, скорость потока 0.8 мл/мин.

Данный метод твердофазной экстракции занимает примерно 35 минут. Затем элюированная фракция выпаривается и растворяется в 0.1% водном растворе уксусной кислоты. Время выпаривания – примерно 10 минут.

Результаты и выводы

Приведенное описание метода показывает, как можно выполнять очистку образцов от патулина с помощью твердофазной экстракции, используя картриджи с MIP специфичные к патулину.

Молекулярно импринтированные полимеры (MIP) – синтетические материалы с искусственно созданной трехмерной сетью, способные специфично связываться с целевой молекулой.

Молекулярно импринтированные полимеры имеют ряд преимуществ: высокая селективность и специфичность, термоустойчивость, совместимость со всеми растворами и низкая себестоимость. Данные полимеры используются, как эффективное средство для очистки и предварительного концентрирования патулина.

ВЭЖХ анализ был выполнен на системе с DAD детектором, патулин определялся на длине волны 276 нм, инжекционный объем – 100 мкл.

ВЭЖХ анализ был использован для количественного определения патулина в образцах. Ниже приведено сравнение хроматограмм образцов яблочного сока загрязненного патулином концентрацией 25 мкг/кг до очистки и после.

ВЭЖХ диаграмма, приведенная ниже, имеет две хроматограммы после очистки образцов, которые были загрязнены патулином концентрацией 40 мкг/кг. График был масштабирован, а ось X хроматограмм смещена для отображения результатов воспроизводимости, полученных данным методом.

Данный метод очистки образцов соответствует нормам ЕС 401/2006. Указанные нормы требуют, чтобы степень извлечения превышала 70% для анализов с концентрацией патулина от 20 до 50 мкг/кг, а так же 50% для анализов с концентрацией ниже 20 мкг/кг. Как показано в таблице 1, данный метод очистки яблочного сока от патулина, загрязненного при концентрации 40 мкг/кг, имеет степень извлечения 80%, что соответствует требованиям ЕС.

Концентрация (нг/мл)	Степень Извлечения %	Повторяемость RSDR (%)
40 (n=2)	80	Не определена

Приведенный метод легко автоматизируется на системе Gilson GX-271 ASPEC, которая обеспечивает высокую повторяемость и воспроизводимость результатов, а так же не требует контроля за ее работой. Gilson GX-271 ASPEC в комплекте с картриджами специфичными к патулину была принята в использование более чем 50 заказчиками, особенно в индустриальных лабораториях контроля качества (Industrial QC labs) в 20 различных странах. Картриджи, наполненные молекулярно импринтированным полимером (MIP) специфичным к патулину, зарекомендовали себя эффективным средством очистки различных продуктов из яблок.